Francisco Pizarro, Diego de Almagro e Hernando de Luque portarono gli spagnoli a conquistare l'Impero Inca. Inizialmente navigarono verso sud nel 1524 lungo il Pacifico da Panama alla ricerca dell'esistenza della leggendaria terra dell'oro chiamata Biru, che in seguito divenne Perù.
Data la rapidità nella sottomissione completa dell'Impero Inca, la conquista fu molto facile. Dopo la morte dell'Inca Huayna Cápac nel 1527, i suoi figli Huascar e Atahualpa combatterono per la successione. Il secondo vinse la battaglia, ma, prima ancora di consolidare il proprio potere, gli Spagnoli, guidati dal conquistador Francisco Pizarro arrivarono nel 1532. Atahualpa non cercò inizialmente di fermarli probabilmente in quanto non credeva nella possibilità che potessero conquistare il Tawantinsuyu. Atahualpa e i suoi uomini furono sconfitti nella battaglia di Cajamarca (Perù) il 16 novembre 1532 e Atahualpa, nonostante la richiesta di un ricchissimo riscatto, venne giustiziato a Cusco, che era stata fino ad allora, la capitale dell'Impero Inca.
A seguito della veloce vittoria di Pizarro, i nativi iniziarono a ribellarsi e continuarono periodicamente durante il perido coloniale. Nel 1537 Manco Inca, che gli spagnoli appoggiarono in quanto molto giovane, si ribellò contro i nuovi governanti e ripristinò un nuovo stato Inca nei pressi di Vilcabamba che sopravvisse fino alla cattura ed esecuzione di Túpac Amaru nel 1572. Le ultime rivolte tra le montagne della Bolivia furono organizzate dagli anziani della comunità e rimasero di dimensione locale. L'unica eccezione fu la rivolta di Túpac Amaru II nel XVIII secolo.
Durante le due prime decadi di governo spagnolo, l'Alto Perù (o Charcas) - come conosciuta all'epoca il territorio montagnoso boliviano - fu terreno di una guerra civile tra le forze di Pizarro e quelle di Almagro. Il nord era sotto il controllo di Pizarro e il sud sotto quello di Almagro. I combattimenti cessarono nel 1537, anno nel quale Almagro conquistò Cusco e represse la rivolta di Manco Inca. Pizarro sconfisse ed uccise Almagro nel 1538, ma venne lui stesso assassinato tre anni dopo dagli uomini di Almagro. Il fratello di Francisco Pizarro, Gonzalo Pizarro, assunse il controllo dell'Alto Perù, ma presto venne coinvolto in una ribellione contro i Reali Spagnoli. Solo con l'esecuzione di Gonzalo Pizarro nel 1548